IBT

Verantwortlich: Prof. C. Wandrey, IBT, c.wandrey@fz-juelich.de

Mittelfristige Aufgaben und Ziele (IBT-1 und IBT-2)

Die Entwicklung biotechnologischer Verfahren zur Herstellung von Pharmaprodukten und Feinchemikalien steht im Mittelpunkt der FE-Arbeiten des Instituts für Biotechnologie. Diese Aktivitäten umfassen sowohl grundlagenorientierte als auch anwendungsbezogene Themen. Als Biokatalysatoren stehen hierbei insbesondere Enzyme, Mikroorganismen und höhere Zellkulturen im Zentrum. Um die Syntheseleistungen dieser verschiedenen biologischen Systeme gezielt verbessern zu können (protein design, metabolic engineering), sind umfangreiche Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Enzymen sowie zum Stoffwechsel und dessen Regulation erforderlich, wozu die modernsten Technologien eingesetzt werden. Ferner werden reaktionstechnische und verfahrenstechnische Arbeiten für eine möglichst optimale Nutzung der Enzyme, Mikroorganismen und tierischen Zellkulturen ausgeführt. Ein relativ neues und zukunftsweisendes Feld ist die Vermehrung von blutbildenden Stammzellen aus Nabelschnurblut von Neugeborenen.

Wichtige Ergebnisse im Jahr 2003

IBT-1

• In Corynebacterium glutamicum konnten in genomweiten Expressionsanalysen mit DNA-Chips die Regulationsmechanismen der verzweigtkettigen Aminosäuren Isoleucin und Leucin charakterisiert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die Pyruvatkinase in C. glutamicum neben der Bereitstellung von ATP und Pyruvat in der Glykolyse essentiell für das Wachstum auf einigen gluconeogenetischen Kohlenstoffquellen ist.
• Für die L-Serinproduktion wurde ein geeigneter Stamm von C. glutamicum entwickelt, bei dem neben der Überexpression der Serin-Biosynthesegene der zellinterne Abbau dieser Aminosäuren verhindert wurde. Durch gezielte Deletion der Serindehydratase und eine verringerte Expression der Serinhydroxymethyltransferase ist es gelungen, einen C. glutamicum Stamm zu konstruieren, der 10 g/l L-Serin ins Medium ausscheidet. Zurzeit werden beim industriellen Kooperationspartner für diesen Stamm die Kulturparameter optimiert. 
• In Fortführung der Arbeiten zur Entwicklung eines Regenerationssystems für das Coenzym NADH in Ganzzell-Biotransformationen wurde ein rekombinanter E. coli Stamm konstruiert, der einen Redox-Zyklus aus einer Formiat-Dehydrogenase zur NADH-Regeneration und einer NADH-abhängigen Mannitol-Dehydrogenase zur D-Fructose Reduktion besitzt. Durch Zufütterung beider Substrate (D-Fructose + Formiat) bildete dieser Biokatalysator mit einem Glukose-Facilitator zur Aufnahme der D-Fructose bis zu 750 mM D-Mannitol. Im Rahmen eines BMBF-Projektes wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Görisch (Berlin) ein Gluconobacter oxydans Stamm entwickelt, mit dem erstmals aus Glucose in hoher Ausbeute 5-Ketoglukonsäure hergestellt werden konnte. Ausgehend von einem Pyruvat-Produktionsstamm von E. coli konnte durch Transformation mit dem Gen für die L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis ein Stamm erhalten werden, der unter anaeroben Bedingungen Glucose und Ammonium effizient in L-Alanin umsetzt.
• Untersuchungen zur Produktion zweier Kohlenhydrat-umwandelnder Enzyme aus dem extremophilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii in dem mesophilen Wirtsbakterium Staphylococcus carnosus zeigten, dass die Sekretion dieser Enzyme in gefalteter Form über den Tat-Weg zu höheren Ausbeuten als die Ausschleusung über den Sec-Weg führte. Basierend auf dem Gen für die essentielle Komponente SecA des Sec-Exportapparats wurde ein neues Selektionssystem entwickelt, das den Verlust des Subtilisin-Gens bei industrieller Herstellung dieses Waschmittelenzyms verhindert.

IBT-2

• Bei der Produktion der Aminosäure L-Lysin mit E. coli wurde durch 13-C-Stoffflussanalyse die Überexpression der Phosphoenolpyruvatsynthase als limitierend identifiziert.
• Bei der Untersuchung der Aromatenbiosynthese mit E. coli über eine Glukosesprungfunktion (Glukoselimitierung … Glukosesättigung) wurde durch cytosolische Metabolitenanalyse der entscheidende Flaschenhals identifiziert und durch Überexpression des entsprechenden Gens aufgehoben.
• Transdiole und Aminocyclitole, die vom Aromatenbiosyntheseweg abzweigen, wurden durch entsprechendes Metabolic Engineering und Fermentationsentwicklungen im kg-Maßstab produziert.
• Mit einer Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus wurde NADPH aus NADP unter Verwendung von Wasserstoff kontinuierlich über 120 h hergestellt. Dabei wurde eine Raum-Zeit-Ausbeute von 53 (g/(L x d)) erreicht.
• Reduzierte Nicotinamid-Kofaktoren können auch elektroenzymatisch gewonnen werden. Dabei wurde eine Raum-Zeit-Ausbeute von mehr als 1 (kg(L x d)) erzielt.
• Durch gezielte Glukoselimitierung bei der Zellkultur kann die zellspezifische Produktivität bei der Herstellung bestimmter potentieller Tumortherapeutika gegenüber ungeregelter Glukoseversorgung mehr als verdoppelt werden.
• Humane Granulozyten (zur Behandlung von Sepsis) konnten ausgehend von Stamm- und Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut in 18 Tagen um den Faktor 4400 expandiert werden (ausreichend für klinische Verwendung).
• Es wurden aus Monozyten T-Lymphozyten für die Beladung von Tumorzell-Lysat für eine Immuntherapie gewonnen. Bei Verwendung eines Influenza Viruspeptids wurde für die entsprechenden T-Zellen ein Expansionsfaktor von 4300 erreicht.
• Mittels konfokaler Laser Raster Fluoreszenzspektroskopie lassen sich konkurrierende Adsorptions- und Desorptionsvorgänge bei der Chromatographie im Inneren von Adsorbern beobachten.
• Biopolymere lassen sich mit Hilfe der Verteilung in wässrigen Zweiphasensystemen charakterisieren und isolieren.