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@PHDTHESIS{Hilbert:40523,
      author       = {Hilbert, Ulrike},
      title        = {{E}x vivo {E}xpansion von humanen {CMV} spezifischen
                      {T}-{L}ymphozyten im {B}ioreaktor},
      volume       = {3938},
      issn         = {0944-2952},
      school       = {Univ. Bonn},
      type         = {Dr. (Univ.)},
      address      = {Jülich},
      publisher    = {Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag},
      reportid     = {PreJuSER-40523, Juel-3938},
      series       = {Berichte des Forschungszentrums Jülich},
      pages        = {I, 184, LIII p.},
      year         = {2001},
      note         = {Record converted from VDB: 12.11.2012; Bonn, Univ., Diss.
                      2001},
      abstract     = {Die $\textit{ex vivo}$ Vermehrung von humanen T-Lymphozyten
                      gewinnt in der medizinischen Anwendung immer mehr an
                      Bedeutung. Ein wichtiger Anwendungsbereich ist die adoptive
                      Immuntherapie zur Bekämpfung viraler Infektionen und
                      Tumoren bei Patienten, deren Immunsystem durch Krankheit
                      oder Behandlung geschwächt ist. Neben der Produktion der
                      für eine Therapie benötigten Zellmengen (bis 10$^{9}$
                      spezifische Zellen) ist die Erhaltung der Teilungsfähigkeit
                      und der biologischen Aktivität von kultivierten und
                      expandierten TLymphozyten nach Transfusion von zentraler
                      Bedeutung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung
                      eines Verfahrens für die Generierung spezifischer
                      T-Lymphozyten. Als biologisches Modell wurde, ausgehend von
                      mononukleären Zellen aus peripherem Blut, die Generierung
                      von Zytomegalievirus spezifischen T-Lymphozyten angestrebt.
                      Es erfolgte eine $\textit{in vitro}$ Charakterisierung von
                      Immunzellen. Neben der ausführlichen Bestimmung von
                      Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie wurde
                      die Effektorfunktion der Immunzellen untersucht. Dabei wurde
                      ein Zytotoxizitätstest, gegen spezielle Zelllinien (K562,
                      Raji und T2 Zelle), basierend auf der Freisetzung von
                      Europium, etabliert und optimiert. Weiterhin wurde die
                      Effektorfunktion dieser Zellen über IFN-$\gamma$ bestimmt.
                      Hierzu wurde ein Test zur intrazellulären Detektion von
                      IFN-$\gamma$ optimiert und ein IFN-$\gamma$ Sekretionstest
                      eingesetzt. Beim Einsatz von stimulierenden Faktoren
                      ($\alpha$CD3 mAb, $\alpha$CD28 mAb und IL-2) konnte eine
                      polyklonale unspezifische Aktivierung und Proliferation von
                      PBMCs erzielt werden. Nach der Untersuchung von
                      verfahrenstechnischen Parametern (Zelldichte, Temperatur,
                      Fütterungsstrategie, Osmolalität, pH-Wert, pO$_{2}$-Wert
                      und IL-2 Verbrauch) konnte unter kontrollierten
                      Prozessbedingungen in einem Suspensionsreaktor und
                      anschließend in einem 20 L Rührkessel die Kultivierung im
                      für Primärzellen großen Maßstab realisiert werden. Dabei
                      wurde eine Gesamtzellzahl von 3$\cdot$10$^{10}$ Zellen mit
                      einem Anteil von >90\% T-Lymphozyten erreicht. Weiterhin
                      zeigten vergleichende Untersuchungen von unspezifischen
                      T-Lymphozyten in Gewebekulturflaschen und Suspensionsreaktor
                      einen Erhalt von HCMV spezifischen T-Lymphozyten nach
                      14tägiger Kultivierung. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein
                      Protokoll zur Generierung von Dendriten aus peripherem Blut
                      etabliert werden. Hierzu wurden adhärente PBMCs nach
                      Plastikadhäsion mit zytokinhaltigem Medium (GM-CSF, IL-4
                      und TNF-$\alpha$) für 9 Tage kultiviert. Die so erhaltenen
                      Zellen exprimierten charakteristische Dendritenmarker und
                      zeigten mit einem sternförmigen Zellkörper und
                      Zellausläufern die dendritentypische Morphologie. In
                      statischen Gewebekultursystemen wurden die Parameter für
                      eine spezifische Stimulation über antigenpräsentierende
                      Zellen zur Generierung HCMV spezifischer T-Lymphozyten
                      optimiert. Als Antigen wurde im Rahmen dieser Arbeit das
                      Matrix Struktur HCMV pp65$_{495-503}$ Peptid und das HCMV AD
                      169 Strain Protein aus Vorhaut Fibroblasten eingesetzt.
                      Dabei wurde die Pulszeit der APCs mit Antigen, die Wahl der
                      APCs, die Zelldichte, das Zellzahlverhältnis zwischen APC
                      und T-Zellen, der Einsatz von serumhaltigem Medium, die IL-2
                      Zugabe, die Ausgangspopulation und die Restimulation
                      untersucht. Mit diesen optimierten Stimulationsparametern
                      wurde eine selektive Generierung von HCMV spezifischen
                      T-Lymphozyten ermöglicht. Nach einer 1 bis 2wöchigen
                      Vorkultur in statischen Kultursystemen konnte anschließend
                      im Suspensionsreaktor eine Kultivierung unter kontrollierten
                      Bedingungen realisiert werden. Nach wöchentlicher
                      spezifischer Restimulation stieg der Anteil der
                      IFN-$\gamma^{+}$-T-Lymphozyten wöchentlich um einen Faktor
                      von 3. Mit einem Anteil von 23,4\% am 28. Tag der
                      Kultivierung konnten somit 7,5$\cdot$10$^{7}$ HCMV
                      spezifische T-Lymphozyten im Reaktor generiert werden. Es
                      wurden Rahmenbedingungen zur Generierung spezifischer
                      T-Lymphozyten entwickelt, die eine Umsetzung in den klinisch
                      relevanten Maßstab ermöglichen.},
      cin          = {IBT-2},
      cid          = {I:(DE-Juel1)VDB56},
      pnm          = {Verfahrenstechnik der Gewinnung},
      pid          = {G:(DE-Juel1)FUEK94},
      typ          = {PUB:(DE-HGF)11 / PUB:(DE-HGF)3},
      url          = {https://juser.fz-juelich.de/record/40523},
}