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| Dissertation / PhD Thesis | PreJuSER-48141 |
2006
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
Jülich
Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/2463
Report No.: Juel-4199
Abstract: E. coli ist für die mikrobielle Herstellung von Feinchemikalien und rekombinanten Proteinen von Bedeutung. Während des Fermentationsprozesses tritt häufig eine als Überflussmetabolismus bezeichnete aerobe Acetatbildung auf. Diese ist aufgrund der Toxizität des Acetats problematisch. Die Kenntnis der molekularen Ursachen der aeroben Acetatbildung, welche für eine effiziente Problembehebung erforderlich ist, war bisher nicht vorhanden. Vorarbeiten haben gezeigt, dass die aerobe Acetatbildung mit Genexpressionsveränderungen korrelierte, welche sowohl Gene des Tricarbonsäurezyklus als auch der Atmungskette sowie weitere Gene (u.a. gadE, actP, yjcH und yjeJ) betrafen. In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: • Die Deregulation des sdhCDAB-b0725-sucABCD-Operons durch chromosomalen Austausch des sdh - Promotors in E. coli MG1655 hatte eine vierfach erhöhte Aktivität der Succinatdehydrogenase und Succinyl-CoA-Synthetase sowie eine 1,7-fach erhöhte Aktivität der a-Ketoglutaratdehydrogenase zur Folge. Die aerobe Acetatbildung des konstruierten Stammes war im Vergleich zum Wildtypstamm bei unverändertem Wachstum und unverändertem Glucoseumsatz um mehr als 50 % reduziert. Es konnte keine Bildung von Nebenprodukten beobachtet werden. Stattdessen trat eine gegenüber dem Wildtyp-Stamm erhöhte CO$_{2}$-Bildung auf, welche durch eine erhöhte in-vivo -Aktivität des TCA-Zyklus erklärt werden kann. Die Deletion der sucCD-Gene führte demgegenüber zur Verringerung der TCA-Zyklus- Aktivität und zu erhöhter Acetatbildung. Dies zeigte, dass die bei Glucoseüberflussmetabolismus auftretende verringerte Synthese der TCA-Zyklus-Enzyme $\alpha$-Ketoglutaratdehydrogenase, Succinyl-CoASynthetase und Succinatdehydrogenase und eine damit verbundene, herabgesetzte Aktivität des TCA-Zyklus primär ursächlich für die aerobe Acetatbildung ist. • Die Deletion der Gene gadE (yhiE), actP (yjcG), yjcH und yjeJ in E. coli MG1655 hatte keinen Einfluss auf den Überflussmetabolismus. Dies zeigte, dass die Expressionsveränderung dieser Gene nicht ursächlich für die aerobe Acetatbildung ist. Die Expressionsveränderung dieser Gene trat möglicherweise als Folge der aeroben Acetatbildung auf. • Durch DNA-Affinitätschromatographie mit der sdh-Promotorregion konnte ein weiterer Transkriptionsregulator des sdhCDAB - b0725 -sucABCD-Operons identifiziert werden: YdcI. Dieser Regulator, welcher aufgrund seiner Sequenz der LysR-Familie zugeordnet wird, konnte aus Zellen angereichert werden, die auf Glucose- Minimalmedium kultiviert wurden. Es ist anzunehmen, dass YdcI an der Regulation der aeroben Acetatbildung beteiligt ist.
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