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| Dissertation / PhD Thesis/Book | PreJuSER-53667 |
2006
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
Jülich
Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/2469
Report No.: Juel-4233
Abstract: Die mikrobielle Synthese der Vitamin C-Vorstufe 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KGLA) kann mit G. oxydans durch Sorbitoloxidation über die Intermediate Sorbose und Sorboson erfolgen. Diese Reaktionen werden von einer membranassoziierten Sorbitol-DH (SLDH), einer membranassoziierten Sorbose-DH (SDH) und einer zytosolischen Sorboson-DH (cSNDH) katalysiert. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten G. oxydans-Stämmen, die mit so hohen für die 2-KGLA-Synthese notwendigen Enzymaktivitäten ausgestattet sind, um Sorbitol effizient zu 2-KGLA zu oxidieren. Zur Konstruktion der rekombinanten 2-KGLA-Produktionsstämme wurde G. oxydans DSM 2343 ausgewählt, da dieser Stamm bei geringer Biomasseproduktion die Oxidation von Sorbitol zu Sorbose vollständig und mit einer sehr hohen Produktbildungsrate durchführte. Für die weitere Umsetzung von Sorbose zu 2-KGLA wurde in G. oxydans DSM 2343 neben den Genen für die SDH und die zytosolische cSNDH auch das Gen einer membrangebundenen SNDH (mSNDH) aus A. liquefaciens funktionell überexprimiert, so dass die 2-KGLA-Synthese vollständig im Periplasma stattfinden konnte. Nachdem die Expression der heterologen Gene auf Transkriptions-, Translations- und Enzymaktivitätsebene überprüft wurde, standen definierte Stämme zur Verfügung, in denen alle zur 2-KGLA-Synthese benötigten Enzyme mit ausreichender Aktivität vorhanden waren. Die SDH/cSNDH-Überproduzenten setzen 100 g/l Sorbitol mit einer spezifischen 2-KGLA-Ausbeute von 7 g 2-KGLA/g Zell-Trockenmasse zu 15 g/l 2-KGLA um. Auch mit den SDH/mSNDH-Überproduzenten konnten bis zu 12 g/l 2-KGLA aus 100 g/l Sorbitol produziert werden. Um die 2-KGLA-Ausbeuten zu steigern, wurde untersucht über welchen Stoffwechselweg Sorbose in G. oxydans abgebaut wird. Dabei konnte der Pentosephosphatweg (PPW) als Hauptstoffwechselweg identifiziert werden. Korrelierend zur Sorboseverwertung und Biomassebildung wurden in einigen G. oxydans-Stämmen bis zu 60 % der Sorbose im PPW zu CO$_{2}$ umgesetzt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Aktivitäten von Transaldolase und Phosphoglukoseisomerase für die PPW-Stoffwechselleistung und damit für die Höhe der CO$_{2}$- und Biomasseproduktion verantwortlich sind. Da in G. oxydans DSM 2343 beide Aktivitäten sehr gering waren, wurden bei der Sorbitol-Biotransformation korrelierend zu der geringen Biomasseproduktion nur 10 % des Substrats zu CO$_{2}$ umgesetzt. Folglich stehen in G. oxydans DSM 2343 etwa 90 % des Substrats für die 2-KGLA-Bildung zur Verfügung, während die 2-KGLA-Ausbeute mit anderen untersuchten Stämmen dadurch begrenzt ist, dass ein Großteil des Substrats im PPW zur Energieerzeugung für den Biomasseaufbau assimiliert wird. Mit den konstruierten G. oxydans DSM 2343-Stämmen stehen somit bezüglich des Sorbosemetabolismus und aller an der 2-KGLA-Synthese beteiligten Enzyme detailliert charakterisierte Stämme zur Verfügung, um die 2-KGLAProduktion durch gezielte Modifikationen im Sorbosestoffwechsel weiter zu verbessern.
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