Book/Report

FZJ-2018-03318

http://join2-wiki.gsi.de/foswiki/pub/Main/Artwork/join2_logo100x88.png Klonierung, Charakterisierung und Amplifikation von Genen der Isoleucinbiosynthese Enzyme aus Corynebacterium glutamicum

Cordes, C. (Corresponding author)FZJ*

1990
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag Jülich

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/18798

Report No.: Juel-2385

Abstract: Die mikrobielle Produktion der Aminosäure L-lsoleucin wurde überwiegend mit Hilfe konventionell hergestellter Mutanten durchgeführt. Die in den letzten Jahren entwickelten Methoden der rekombinanten DNA-Technologie für Corynebakterien ermöglichen es, durch Überexpression von Genen des Aminosäurestoffwechsels die Produktion der gewünschten Aminosäure zu steigern. In der vorliegenden Arbeit wurden Gene der Isoleucinbiosynthese isoliert, charakterisiert und ihre Auswirkung auf die Bildung von L. Isoleucin bei $\textit{C. glutamicum}$ verfolgt. 1. Vier Gene der Isoleucinbiosynthese-Enzyme aus $\textit{C. glutamicum}$ ATCC 13032 wurden durch heterologe Komplementation von Isoleucineauxotrophen $\textit{E. coli}$-Mutanten isoliert: $\underline{ilvA}$ (Threonindehydratasegen), $\underline{ilvBN}$ (Acetohydroxysäuresynthasegene), $\underline{ilvC}$ (Isomeroreductasegen), sowie ein die $\underline{ilvE}$ (Transaminase B-Gen) $\textit{E. coli}$-Mutante komplementierendes DNA-Fragment. Das Gen der Dihydroxysäuredehydratase, $\underline{ilvD}$, konnte durch heterologe und homologe Komplementation der entsprechenden Isoleucin-auxotrophen $\textit{E. coli}$- und $\textit{C. glutamicum}$-Mutante nicht isoliert werden. 2. Die Gene der Acetohydroxysäuresynthase und der Isomeroreductase bilden im $\textit{C. glutamicum}$ Genom ein Cluster der Anordnung, $\underline{ilvBNc}$. Die Transkription beider Gene erfolgt in gleicher Richtung. Beide Gene konnten getrennt voneinander in $\textit{C. glutamicum}$ und $\textit{E.coli}$ exprimiert werden. Durch Deletionsanalyse und Transposonmutagenese konnte der codierende Bereich des Gens der Isomeroreductase auf 1,2 kb, der codierende Bereich der Acetohydroxysäuresynthase auf 3,0 kb eingegrenzt werden. 3. Bei Kionierung des $\underline{ilvA}$, $\underline{ilvBN}$ und $\underline{ilvC}$-Gens in die$\textit{C. glutarnicum}$-Stämme ATCC 13032 und DL2 konnte eine Steigerung der spezifischen Aktivität der durch diese Gene codierten Enzyme um den Faktor 20 bis 30 erzielt werden. Die Kionierung des $\underline{ilvE}$-DNA-Fragmentes führte nicht zu einer Überexpression in $\textit{C. glutamicum}$ 4. Bei Fermentationen mit den $\underline{ilvA}$- und $\underline{ilvBNC}$-Genen enthaltenden rekombinanten $\textit{C. glutamicum}$-Stämmen wurde eine Verdopplung der Isoleucinausscheidung erreicht. Bei Zugabe von Glucose als Substrat fand eine Steigerung von 1 mM auf 3 bis 4 mM Isoleucin statt, bei Zugabe der Synthesevorstufe 2-Hydroxybutyrat von 16 mM auf 36 mM, bzw. mit Stamm DL2 von 37 mM auf 70 mM.

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Contributing Institute(s):

1. Publikationen vor 2000 (PRE-2000)

Research Program(s):

1. 899 - ohne Topic (POF3-899) (POF3-899)

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Database coverage:

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