Möckel, B. (Corresponding author) ; Institut für Biotechnologie (Jülich, 1) ; Universität (Düsseldorf)

1994
Forschungszentrum Jülich Jülich

Report No.: Juel-2906

Abstract: Die allosterisch regulierte Threonindehydratase ist das Sehliisselenzym der L-Isoleucinbiosynthese. Ziel dieser Arbeit war es, das Enzym aus Corynebacterium glutamieum und das entspreehende Gen zu eharakterisieren und in der allosterisehen Regulation veranderte Enzyme zu schaffen, • In Substratsiittigungskurven zeigt sieh in Anwesenheit von Isoleuein ein Anstieg des Halbmaxirnalen Siittigungswertes (Ko,s) von 21 auf 78 mM. Die Kooperativitiit nimmt zu, was sieh in einem Anstieg des Hill-Koeflizienten von 2,4 auf 3,7 ausdriiekt. • Das fiir die Threonindehydratase kodierende ilvA Gen liegt im Genom nieht zusammen mit ilvB, ilvN und ilvC vor. Aus der ermittelten Nukleotidsequenz des ilvA Gens liiBt sieh ein Polypeptid von 436 Aminosiiuren ableiten. Vier Untereinheiten bilden das native Enzym. Dieses wurde isoliert und zur Herstellung polyklonaler Antikorper benutzt. Aus Vergleiehen mit homologen Enzymen liiJ3t sieh herleiten, daf die Threonindehydratase in C. glutamieum aus einer katalytisehen und einer regulatorisehen Domane besteht. • Mit eomputergestiitzten Methoden wurde ein dreidimensionales Modell der Threonindehydratase dureh "modelling by homology" erstellt. Dieses Modell zeigt, daf zwei die Domanen des Enzyms aueh topologiseh getrennt vorliegen. • Neunzehn versehiedene Aminosiiureaustausehe wurden vorgenommen, bzw. mutierte Gene naeh Selektion in einem biologisehen System sequenziert. Dadureh wurde ein Spektrum veranderter Enzyme erhalten, die kinetiseh eharakterisiert wurden. Sie sind inaktiv, teilweise aktiv, partiell hemmbar oder nicht mehr hemmbar. Am auffalligsten ist der Austauseh von Valin 323 gegen Alanin, Dieser fiihrt zur vollstandigen Aufhebung der allosterisehen Hemmbarkeit dureh Isoleuein, ohne daB die katalytisehe Aktivitiit beeintrachtigt ist. Die Lokalisierung der versehiedenen Mutationsorte im dreidimensionalen Modell zeigt, daf Aminosaureaustausche, die zu einer Aufhebung der allosterisehen Regulation fiihren, bevorzugt an der Oberfliiehe des Polypeptids liegen. • Eine Auswahl versehiedener ilvA Allele wurde in Threonin-Produktionsstiimmen von C. glutamieum exprimiert. Dureh Synthese des Enzyms mit dem Aminosaureaustauseh Valin 323 gegen Alanin liiBt sieh bis zu 125mM L-Isoleucin akkumulieren, ohne daf noch Threonin oder Threonin-Abbauprodukte naehweisbar sind

Keyword(s): enzyme ; bacterium ; mutation ; molecular genetics

1. Institut für Biotechnologie (IBT)