Book/Report

FZJ-2019-00610

http://join2-wiki.gsi.de/foswiki/pub/Main/Artwork/join2_logo100x88.png Isolierung und funktionelle Charakterisierung des secA-Gens aus $\textit{Staphylococcus carnosus}$ und eines azidresistenten secA-Allels von $\textit{Bacillus subtilis}$

Klein, M. (Corresponding author)FZJ*

1995
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag Jülich

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/21343

Report No.: Juel-3072

Abstract: Gram-positive Bakterien können große Mengen von Proteinen ins Medium sekretieren und werden deshalb zur Herstellung von Enzymen in industriellem Maßstab verwendet. Überraschenderweise ist über den Mechanismus des Proteinexportes bei diesen industriell bedeutenden Bacillus Stämmen weniger bekannt als bei dem Gram-negativen Bakterium $\textit{Escherichia coli}$. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Eigenschaften einer der zentralen Komponenten desExportapparates, des SecA-Proteins, von Gram-positiven Bakterien untersucht. Mit Hilfe des $\textit{secA}$-Gens aus $\textit{B.subtilis}$ als Sonde konnte das $\textit{secA}$-homologe Gen von $\textit{S.carnosus}$ isoliert werden. Das Gen von 2532 Bp kodiert für ein Protein mit 844 Aminosäuren, das damit im Größenbereich des SecA-Proteins aus $\textit{B.subtilis}$ (841 Aminosäuren) liegt und mit diesem 59,8% identische Aminosäuren aufweist. Die Organisation auf dem Chromosom deutet darauf hin, daß das $\textit{S.carnosus secA}$-Gen ähnlich wie das $\textit{B.subtilis secA}$-Gen von einem eigenen Promotor transkribiert wird. Weiterhin wurde vor dem $\textit{secA}$-Gen von $\textit{S. carnosus}$ ein Gen identifiziert, das in seiner Lage und in der von im abgeleiteten Aminosäuresequenz große Ähnlichkeit mit dem $\textit{orfl}$-Gen von $\textit{B.subtilis}$ hat. Der Vergleich des $\textit{S.carnosus}$ SecA-Proteins mit weiteren SecA-homologen Proteinen zeigt vor allem in der N-terminalen Region hoch konservierte Bereiche, die von Aminosäure 96-103 und 195-203 das A-Motiv bzw. B-Motiv der ATP-Bindungsstelle umfassen. Das $\textit{S.carnosus secA}$-Gen wurde in verschiedenen $\textit{E.coli}$ und $\textit{B.subtilis}$ Stämmen exprimiert und die physiologischen Eigenschaften des $\textit{S.carnosus}$ SecA-Proteins wurden mit denen der SecA-Proteine aus $\textit{E.coli}$ und $\textit{B.subtilis}$ verglichen. Im Gegensatz zum SecA-Protein aus $\textit{B.subtilis}$ zeigte das $\textit{S.carnosus}$ SecA in $\textit{E.coli}$ secA-Mutanten keine Komplementation des Wachstumsdefektes. Die Ursache hierfür liegt sehr wahrscheinlich in strukturellen Unterschieden zwischen dem $\textit{S.carnosus}$ SecA und dem $\textit{E.coli}$ SecA, die eine Inkompatibilität zwischen dem $\textit{S.carnosus}$ SecA-Protein und dem $\textit{E. Coli}$ Proteinexportapparat zur Folge haben. Demgegenüber konnte das $\textit{S.carnosus}$ SecA sowohl den Wachstumsdefekt als auch den Proteinexportdefekt der $\textit{B.subtilis secA}$-Mutante NIG1152 komplementieren. Die Lipase aus $\textit{S.hyicus}$ wurde hierbei mit einer guten, wenn auch im Vergleich zum $\textit{B.subtilis}$ Wildtyp Stamm etwas verlangsamten Kinetik exportiert, während im Gegensatz dazu das äußere Membranprotein OmpA aus $\textit{E.coli}$ nicht exportiert wurde . Der Defekt beim Export des OmpA-Proteins könnte auf einer Defizient bei der Ausbildung des Komplexes aus dem Gram-positiven $\textit{S.carnosus}$ SecA-Proteins und dem Gram-negativen Vorläufer beruhen und/oder durch eine Störung bei der Initiation der Translokation an der Membran bedingt sein. Durch die Selektion auf azidhaltigem Nährmedium wurde die $\textit{B.subtilis}$ secA-Mutante MIK10 isoliert, die in Anwesenheit von Azid wachsen kann. Für die Resistenz gegenüber Azid ist eine Mutation im SecA-Protein verantwortlich, die auf in einem Austausch der in allen SecA-homologen Proteinen konservierten Glutaminsäure in Position 338 gegen Glycin besteht. Die Hemmung des Proteinexportes, der im Wildtyp bei Anwesenheit von Azid beobachtet wurde, wurde durch diese Mutation wieder aufgehoben. Das Wildtyp $\textit{secA}$-Gen zeigt dabei beim Test auf Azidresistenz eine deutliche Dominanz über das azidresistente $\textit{secA}$-Allel. Die Mutation führte jedoch neben der Azidresistenz zu einem Wachstums- und Proteinexportdefekt bei niedrigen Temperaturen. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß das SecA-Protein in $\textit{B.subtilis}$, wie in $\textit{E.coli}$, den Hauptangriffspunkt für die Wachstumshemmung durch Azid darstellt und so die höchste Empfindlichkeit aller zellulären ATP-asen gegenüber Azid aufweist.

---

Contributing Institute(s):

1. Publikationen vor 2000 (PRE-2000)

Research Program(s):

1. 899 - ohne Topic (POF3-899) (POF3-899)

---

Database coverage:

---