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| Book/Report | FZJ-2019-01539 |
1996
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
Jülich
Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/21700
Report No.: Juel-3260
Abstract: Der filamentöse Pilz $\textit{Ashbya gossypii}$ wird industriell zur Riboflavinproduktion genutzt. Hierbei werden die höchsten Riboflavinausbeuten durch die Verwendung von Pflanzenölen als Substrat erzielt. Um die Produktion gezielt verbessern zu können, ist das Verständnis der Physiologie des Ölabbaus und der Riboflavinproduktion unerläßlich. Im Glyoxylatzyklus, der Mikroorganismen das Wachstum auf Triglyceriden ermöglicht, stellt die Isocitrat-Lyase (ICL) das Schlüsselenzym dar. Die 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat Synthase (HBS), die aus Ribulose-5-P einen ausschließlich für die Biosynthese des Riboflavinmoleküls benötigten C$_{4}$-Körper liefert, stellt ein weiteres Schlüsselenzym dar. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Enzyme Isocitrat-Lyase und HBS in $\textit{A. gossypii}$ zucharakterisieren und deren Regulation zu untersuchen. Bei Wachstum auf Sojaöl konnte die Isocitrat-Lyase in $\textit{A. gossypii}$ mit einer maximalen spezifischenAktivität von 0,4 U (mg Protein=$^{-1}$ nachgewiesen werden. Dagegen ließ sich während des Wachstums auf Glucose keine ICL-Aktivität detektieren; erst nach Glucoseverbrauch wurde beim Abbau des intrazellulären Reservefetts die ICL gebildet. Die experimentellen Daten zeigten eine Korrelation zwischen der spezifischen ICL-Aktivität und der Riboflavinbiosynthese. Um die Regulation des Enzyms auf Aktivitätsebene durch Stoffwechselmetabolite untersuchen zu können, wurde es mit Hilfe einer fraktionierten Ammoniumsulfat-Fällung, einer anschließenden Gelfiltration und einer Kationenaustauscher-Chromatographie 108-fach aufgereinigt. Das native Enzym ist ein Tetramer mit einem M$_{r}$ von 254 000 bestehend aus vier identischen Untereinheiten (M$_{r}$ von 66000). Für Isocitrat wurde bei einem pH-Optimum von pH 7,0 ein K$_{m}$-Wert von 0,55 mM bestimmt. Die Enzymaktivität ist Mg$^{2+}$-abhängig und wird durch Metabolite auf Ebene der Enzymaktivität nicht reguliert. Ein sehr wirksamer unphysiologischer ICL-Hemmstoff ist Itaconat (K$_{i}$-Wert: 0,17 mM); bei Hemmung der ICL durch Itaconat synthetisierte der $\textit{A. gossypii}$ Wildtyp kein Riboflavin mehr. In einem Screening auf Itaconat-resistente Mutanten konnte ein Stamm von $\textit{A. gossypii}$ (Ita-GS01) isoliert werden, der bei Wachstum auf Sojaöl einen im Vergleich zum Wildtyp deutlich erhöhten Riboflavingehalt zusammen mit einer um mindestens 15 % erhöhten spezifischen ICL-Aktivität aufwies. Dies deutet auf eine limitierende Rolle der ICL im Kohlenstofffluß vom Substrat zum Produkt hin. Mit Hilfe der Immuno-Blot-Technik ließ sich über eine Korrelation der Enzymaktivität mit der vorhandenen Enzymmenge die Regulation der ICL auf Ebene der Enzymbildung nachweisen. Lokalisierungsstudien ergaben, daß die ICL bei Wachstum auf Sojaöl zusammen mit einer NADP-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase (ICDH) in Peroxisomen vorliegt. Die im Vergleich zur ICL höhere Affinität dieses Enzyms zu Isocitrat (K$_{m}$-Wert: 0,11 mM) macht eine $\textit{in vivo}$ Kompetition dieser beiden Enzyme um das gemeinsame Substrat möglich. Obgleich die Funktion der NADP-abhängigen ICDH ungeklärt ist, so eröffnet sie doch einen potentiellen Nebenweg im Kohlenstofffluß vom Substrat in Richtung Gluconeogenese. [...]
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